ВВЕДЕНИЕ / INTRODUCTION
Коронавирус второго типа, вызывающий тяжелый респираторный синдром и впервые выявленный в конце 2019 г., относится к семейству Coronaviridae, широко распространенному в среде млекопитающих. До 80% случаев инфекции SARS-CoV-2 протекают бессимптомно [1–3], при этом носители могут заражать других лиц [4].
Симптомы COVID-19 часто схожи с проявлениями других респираторных инфекций, потому необходимы высокоспецифичные и чувствительные методы, позволяющие проводить дифференциальную диагностику. Основным методом этиологической диагностики как острых респираторных вирусных инфекций, так и COVID-19 является исследование биологического материала из верхних и нижних дыхательных путей с помощью амплификации нуклеиновых кислот, наиболее распространенный из которых – метод полимеразно-цепной реакции (ПЦР)1.
Кроме того, лабораторная диагностика используется в целях организации противоэпидемиологических мер, в т.ч. тестирования людей, прибывших из мест с неблагоприятной эпидемиологической обстановкой, контактных лиц, даже не имеющих симптомов заболевания2.
У коронавирусов есть механизмы редактирования ошибок РНК-зависимой РНК полимеразы (RdRP), поэтому скорость мутаций ниже, чем у других РНК-содержащих вирусов [5]. Однако это не исключает накопления замен в геноме вируса [6][7]. Центр по контролю и профилактике болезней (Center for Disease Control and Prevention, CDC) Китая рекомендует использовать для тестирования два участка генома вируса – ORF1ab и ген N [8], CDC США – три участка гена N [9]. Также показали эффективность тест-системы, выявляющие коронавирус нового типа по другим генам – ORF1a, ORF1ab, RdRP, E, N, S [10][11].
Цель – разработка и валидация набора реагентов для качественного определения рибонуклеиновых кислот (РНК) коронавируса SARS-CoV-2 методом ПЦР с детекцией в режиме реального времени, адаптированной для использования совместно с наборами для экстракции РНК в автоматическом режиме.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ / MATERIAL AND METHODS
Определение предела обнаружения / Determination of limit detection
Предел обнаружения определяли с использованием стандартного образца SARS-CoV-2 (EDX SARS-CoV-2 Standard, Bio-Rad, США). Стандарт представляет собой синтетические РНК-транскрипты, содержащие 5 генов коронавируса (E, N, ORF1ab, RdRP и S). Разведение стандарта до концентраций 1000, 500, 250 и 100 копий/мл осуществляли на образцах мазков со слизистой рото- и носоглотки, не содержащих РНК коронавируса нового типа.
Экстракцию РНК проводили с использованием набора реагентов «АмплиПрайм ФАСТ-Р» (ООО «НекстБио», Россия) по методике с использованием автоматической станции для экстракции нуклеиновых кислот Microlab STARlet (Hamilton Bonaduz AG, Швейцария, регистрационное удостоверение № РЗН 2018/6981 от 5 апреля 2018 г.).
Определение воспроизводимости и повторяемости / Determination of reproducibility and repeatability
Воспроизводимость и повторяемость определяли тестированием 60 повторов клинических образцов, содержащих РНК SARS-CoV-2 в концентрации 104 копий/мл, полученных из Научно-исследовательского института скорой помощи им. Н.В. Склифосовского после проведения плановых исследований.
Концентрацию SARS-CoV-2 определяли относительно стандартных образцов предприятия (ООО «НекстБио», Россия). Экстракцию РНК проводили с использованием набора реагентов «АмплиПрайм ФАСТ-Р» по методике с использованием автоматической станции для экстракции нуклеиновых кислот Microlab STARlet.
Клинические испытания / Clinical tests
Клинические испытания были проведены с использованием биологического материала, полученного в ходе лечебно-диагностического процесса после проведения плановых лабораторных исследований. Исследованный материал включал:
- мазки со слизистой носо- и ротоглотки (132 образца);
- мокроту (112 образцов).
Биологический материал мазков со слизистой носо- и ротоглотки был забран в транспортную среду для хранения и транспортировки респираторных мазков (ООО «НекстБио», Россия, РУ № ФСР 2012/14200).
Экстракцию РНК из 100 мкл биоматериала проводили с помощью наборов реагентов «МагноПрайм ЮНИ» (ООО «НекстБио», Россия) по методике с использованием автоматической станции для экстракции нуклеиновых кислот Microlab STARlet и «АмплиПрайм РИБО-преп» (ООО «НекстБио», Россия) в ручном режиме. Тесты ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ) выполняли на приборах планшетного типа (С1000 Touch в комплекте с модулем CFX96, Bio-Rad Laboratories, США) и роторного типа (Rotor-Gene Q, Qiagen, Германия).
Аналитическую специфичность набора оценивали тестированием нуклеиновых кислот микроорганизмов и вирусов и геномной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) человека. Нуклеиновые кислоты микроорганизмов и вирусов в концентрации не менее 106 копий/мл и геномную ДНК человека в концентрации 1 мкг/мл вносили в образцы биологического материала, не содержащие вирус SARS-CoV-2.
В исследование были включены следующие микроорганизмы: B. parapertussis, B. pertussis, B. bronchiseptica, H. influenzaе, K. pneumonia, S. aureus, S. pneumoniae, L. pneumophilia, P. aeruginosa, вирусы гриппа А H1N1, H3N2, H2N2, H7N9, H0N1, H5N1, вирус гриппа В линии Брисбен, вирус гриппа В линии Пхукет, коронавирусы человека 229Е, NL63, OC43.
Для оценки влияния интерферирующих веществ в исследуемые образцы были внесены муцин (Sigma-Aldrich, США) в концентрации 0,23 мг/100 мкл, гемоглобин (Sigma-Aldrich, США) – 0,20 ммоль/100 мкл, мирамистин (ООО «Инфамед К», Россия) – 0,001% действующего вещества в 100 мкл, хлоргексидин (ОАО НПЦ «Биоген», Россия) – 0,5% действующего вещества в 100 мкл.
В качестве набора сравнения был использован набор реагентов «РеалБест РНК SARS-CoV-2» (АО «Вектор-Бест», Россия). Экстракцию РНК из образцов биоматериала выполняли с помощью набора «РеалБест УниМаг» (АО «Вектор-Бест», Россия), тесты ОТ-ПЦР – на приборе Rotor-Gene Q (Qiagen, Германия).
Этические аспекты / Ethical aspects
Биологический материал, использованный для проведения работы, был получен после рутинных исследований. Дизайн исследования не был связан с риском для пациентов и не оказывал влияния на их права и благополучие. Способ получения материала не позволял провести идентификацию лица, от которого данный материал был получен. Исходя из этого одобрения этического комитета не требовалось.
Методы статистического анализа / Methods of statistical analysis
Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием пакета Excel MS Office (Microsoft, США). Расчет клинической чувствительности (Ч) выполняли по формуле:
Ч = А / (А + В),
где А – количество истинно-положительных результатов; В – количество ложноотрицательных результатов.
Расчет клинической специфичности (Сп) проводили по формуле:
Сп = D / (D + C),
где D – количество истинно-отрицательных результатов; С – количество ложноположительных результатов.
Расчет нижней границы 95% доверительного интервала чувствительности (Чн) и специфичности (Спн) выполняли по формулам [12]:
где Zγ – значение γ-квантиля нормального распределения (γ =1−α/2, α = 0,05).
РЕЗУЛЬТАТЫ / RESULTS
Контроль качества / Quality control
Для контроля качества экстракции использовали внутренний контрольный образец, представляющий собой модифицированный фаг MS2. Отсутствие сигнала по внутреннему контролю говорит о неэффективной экстракции РНК из клинического материала, образец признается невалидным, требуется его повторный анализ начиная с этапа экстракции. Все результаты признаны валидными на основании амплификации внутреннего контрольного образца.
Контроль качества проведения анализа осуществляли с помощью положительного контрольного образца, представляющего собой модифицированный фаг MS2, несущий фрагмент РНК SARS-CoV2.
Автоматическая экстракция нуклеиновых кислот / Automatic extraction of nucleic acids
Для валидации автоматического метода экстракции РНК из клинического материала была проведена одновременная экстракция наборами реагентов «АмплиПрайм РИБО-преп» (ручной метод) и «МагноПрайм ЮНИ» с использованием автоматической станции для экстракции нуклеиновых кислот Microlab STARlet. При использовании двух выделительных наборов, а также при проведении ОТ-ПЦР на двух приборах не было получено ни одного ложноположительного и ложноотрицательного результата. Все полученные результаты совпали.
Время, затрачиваемое на проведение экстракции РНК из 96 образцов с использованием станции Microlab STARlet, составило 1 ч 10 мин. Экстракция РНК набором реагентов «АмплиПрайм РИБО-преп» из 12–24 образцов занимает 45 мин. Длительность программы амплификации составляет 90 мин. Таким образом, общее время, затрачиваемое на анализ при использовании автоматической станции, укладывается в 3 ч.
Аналитические характеристики / Analytical characteristics
Результаты определения предела обнаружения при тестировании разведения стандартного образца SARS-CoV-2 представлены в таблице 1, результаты исследования повторяемости и воспроизводимости – в таблице 2.
Таблица 1. Результаты определения предела обнаружения при тестировании разведения стандартного образца SARS-CoV-2
Table 1. Results of limit detection evaluation during testing the standard SARS-CoV-2 sample
Примечание. РНК – рибонуклеиновая кислота; Сt – количество циклов репликации, необходимое для формирования флюоресцентного сигнала; ДИ – доверительный интервал.
Note. RNA – ribonucleic acid; Ct – number of replication cycles required for fluorescent signal; CI – confidence interval.
Таблица 2. Повторяемость и воспроизводимость полученных результатов
Table 2. Repeatability and reproducibility of the results
Примечание. РНК – рибонуклеиновая кислота; Сt – количество циклов репликации, необходимое для формирования флюоресцентного сигнала; ДИ – доверительный интервал; CV – коэффициент вариации.
Note. RNA – ribonucleic acid; Ct – number of replication cycles required for fluorescent signal; CI – confidential interval; CV – variation coefficient.
При исследовании аналитической специфичности перекрестных реакций с указанными возбудителями не выявлено.
Клинические характеристики / Clinical characteristics
Для исследования клинической специфичности и чувствительности нового набора были изучены 244 образца биологического материала одновременно с референсным набором «РеалБест РНК SARS-CoV-2». Все полученные результаты были признаны валидными на основании амплификации внутреннего контроля образца в исследуемом и референсном тестах.
При исследовании 132 образцов мазков со слизистой носои ротоглотки обнаружено 66 образцов, содержащих РНК SARS-COV-2, из 112 образцов мокроты – 56 положительных. Исследование с использованием референсного набора показало полное совпадение положительных и отрицательных результатов. На основании полученных данных была рассчитана диагностическая чувствительность и специфичность с учетом 95% доверительной вероятности. Результаты представлены в таблице 3.
Таблица 3. Диагностическая чувствительность и специфичность набора реагентов «АмплиПрайм SARS-CoV-2 DUO» (ООО «НекстБио», Россия)
Table 3. Diagnostic sensitivity and specificity of the AmpliPrime SARS-CoV-2 DUO reagent kit (NextBio LLC, Russia)
Примечание. ДИ – доверительный интервал.
Note. CI – confidence interval.
Внесение в клинический материал интерферирующих веществ в указанных концентрациях не привело к получению ложноотрицательных результатов.
ОБСУЖДЕНИЕ / DISCUSSION
Молекулярно-биологические методы выявления РНКи ДНК-возбудителей респираторных инфекций широко применяются в клинической практике и служат как для установления этиологической причины заболевания, так и для эпидемиологического надзора. Как показывают события 2020–2021 гг., это играет первостепенную роль в предотвращении распространения пандемии.
По данным коммуникационного штаба Правительства Российской Федерации [13], на начало ноября 2021 г. количество ПЦР-исследований составило более 500 тыс. в день, из них более 40 тыс. были положительными. Такое количество выполняемых анализов неизбежно означает огромную нагрузку на клинико-диагностические лаборатории, поэтому необходимы решения, которые позволили бы проводить исследования в максимально автоматическом режиме и при этом оставались бы экономически оправданными.
Одной из основных задач нашей работы было определение аналитических и диагностических характеристик разработанного набора реагентов с использованием автоматических станций для экстракции нуклеиновых кислот.
Чувствительность набора реагентов при тестировании стандартного образца EDX SARS-CoV-2 составила 250 копии/мл, что равно 0,25 копии/мкл, или 2,5 копии на реакцию. Для сравнения, по имеющимся литературным данным, чувствительность анализа при использовании олигонуклеотидов, предложенных CDC для выявления SARS-CoV-2, составила от 0,3 до 2,1 копии/мкл [14]. Из отечественной практики опубликованы данные об аналитических характеристиках набора реагентов производства ООО «ДНК-Технология» с чуть более низкой чувствительностью: 10 копий на реакцию [15]. Основным различием проведенных исследований является использование нами внешнего количественно охарактеризованного стандартного образца, содержащего РНК SARS-CoV-2, что, возможно, позволило более точно определить чувствительность набора реагентов.
Коэффициент вариации при исследовании воспроизводимости результатов амплификации составил менее 5%. По литературным данным, при валидации наборов реагентов либо были получены схожие значения (не более 5%) [16], либо коэффициент вариации был выше (от 1,16% до 8,65%) [17].
Автоматические станции для выделения нуклеиновых кислот и приготовления ПЦР-смесей имеют ряд преимуществ перед ручными методами экстракции, в первую очередь за счет большей пропускной способности и стандартизованности процедуры экстракции. Длительность исследования с помощью станции для экстракции нуклеиновых кислот Microlab STARlet при анализе 96 образцов составила 1 ч 10 мин. Экстракция такого же количества образцов ручным методом занимает около 3 ч. При использовании автоматической станции весь анализ, включая этап экстракции и амплификации, длится на более 3 ч.
Важным этапом валидации набора реагентов является сравнение результатов с другим набором реагентов, зарегистрированным в Федеральной службе по надзору в сфере здравоохранения в установленном порядке. В качестве набора сравнения нами был использован набор реагентов «РеалБест РНК SARS-CoV-2». Различия в результатах могут быть связаны с разными областями генома, амплифицируемыми в ходе анализа, разной чувствительностью и методами экстракции нуклеиновых кислот. Несмотря на имеющиеся различия, сравниваемые наборы реагентов показали схожую чувствительность и специфичность.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ / CONCLUSION
В ходе исследования был разработан и апробирован набор реагентов «АмплиПрайм SARS-CoV-2 DUO» (ООО «НекстБио», Россия) для выявления коронавируса нового типа. Набор определяет SARS-CoV-2 по двум фрагментам генома, что позволяет повысить надежность анализа. Предел обнаружения составил 250 копий/мл, что достаточно для надежного анализа. Коэффициент вариации при тестировании 120 образцов, содержащих РНК SARS-CoV-2 в концентрации 104 копий/мл, не превышает 5%.
Набор реагентов получил регистрационное удостоверение РЗН № 2020/10837 от 15 июня 2020 г. и может быть использован в клинической практике.
1. Gorbalenya A.E., Baker S.C., Baric R.S., et al. The species Severe acute respiratory syndrome related coronavirus: classifying 2019-nCoV and naming it SARS-CoV-2. Nat Microbiol. 2020; 5: 536–44. https://doi.org/10.1038/s41564-020-0695-z.
2. Oran D.P., Topol E.J. Prevalence of asymptomatic SARS-CoV-2 infection: a narrative review. Ann Intern Med. 2020; 173 (5): 362–7. https://doi.org/10.7326/M20-3012.
3. Dos Santos W.G. Natural history of COVID-19 and current knowledge on treatment therapeutic options. Biomed Pharmacother. 2020; 129: 110493. https://doi.org/10.1016/j.biopha.2020.110493.
4. Aguirre-Duarte N. Can people with asymptomatic or pre-symptomatic COVID-19 infect others: a systematic review of primary data. medRxiv. April 16, 2020. https://doi.org/10.1101/2020.04.08.20054023.
5. Sevajol M., Subissi L., Decroly E., et al. Insights into RNA synthesis, capping, and proofreading mechanisms of SARS-coronavirus. Virus Res. 2014; 194: 90–9. https://doi.org/10.1016/j.virusres.2014.10.008.
6. Hu B., Guo H., Zhou P., et al. Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19. Nat Rev Microbiol. 2021; 19: 141–54. https://doi.org/10.1038/s41579-020-00459-7.
7. Tang X., Wu C., Li X., et al. On the origin and continuing evolution of SARS-CoV-2. Nat Sci Rev. 2020; 7 (6): 1012–23. https://doi.org/10.1093/nsr/nwaa036.
8. Niu P., Lu R., Zhao L., et al. Three novel real-time RT-PCR assays for detection of COVID-19 virus. China CDC Wkly. 2020; 2 (25): 453–7. https://doi.org/10.46234/ccdcw2020.116.
9. CDC’s diagnostic test for COVID-19 only and supplies. URL: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/virus-requests.html (дата обращения 20.11.2021).
10. Corman V.M., Landt O., Kaiser M., et al. Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Euro Surveill. 2020; 25(3): 2000045. https://doi.org/10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045.
11. Kubina R., Dziedzic A. Molecular and serological tests for COVID-19 a comparative review of SARS-CoV-2 coronavirus laboratory and point-of-care diagnostics. Diagnostics (Basel). 2020; 10 (6): 434. https://doi.org/10.3390/diagnostics10060434.
12. Красько О.В. Статистический анализ данных в медицинских исследованиях. Часть I. Минск: МГЭУ им. А.Д. Сахарова; 2014: 127 с.
13. Отчeт о текущей ситуации по борьбе с коронавирусом. 3 ноября 2021. URL: https://xn--80aesfpebagmfblc0a.xn--p1ai/ai/doc/1122/attach/2021-11-03_coronavirus_government_report.pdf (дата обращения 20.11.2021).
14. Tastanova A., Stoffel C.I., Dzung A., et al. A comparative study of real-time RT-PCR-based SARS-CoV-2 detection methods and its application to human-derived and surface swabbed material. J Mol Diagn. 2021; 23(7): 796–804. https://doi.org/10.1016/j.jmoldx.2021.04.009.
15. Гончарова Е.В., Донников А.Е., Кадочникова В.В. и др. Диагностика вируса, вызывающего COVID-19, методом ПЦР в реальном времени. ФАРМАКОЭКОНОМИКА. Современная фармакоэкономика и фармакоэпидемиология. 2020; 13 (1): 52–63. https://doi.org/10.17749/2070-4909.2020.13.1.52-63.
16. Watanabe R., Asai S., Kakizoe H., et al. Evaluation of the basic assay performance of the GeneSoc ® rapid PCR testing system for detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2. PLoS One. 2021; 16 (3): e0248397. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0248397.
17. Perng C.L., Jian M.J., Chang C.K., et al. Novel rapid identification of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) by real-time RT-PCR using BD Max Open System in Taiwan. Peer J. 2020; 8: e9318. https://doi.org/10.7717/peerj.9318.
Описание
Набор реагентов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 тяжелого острого респираторного синдрома (COVID-19) методом полимеразной цепной реакции «АмплиПрайм® SARS-CoV-2 DUO» по ТУ 21.20.23-083-09286667-2020 предназначен для качественного обнаружения РНК коронавируса SARS-CoV-2 в биологическом материале (мазках со слизистой носо- и ротоглотки, мокроте) при диагностике лиц с клинической симптоматикой респираторного заболевания с подозрением на инфекцию COVID-19 или лиц, не имеющих признаков простудных заболеваний и не являющихся контактными с больными COVID-19 методом ОТ-ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени». Материалом для проведения ОТ-ПЦР служат пробы РНК, экстрагированные из исследуемого материала с помощью наборов реагентов, рекомендованных в
инструкции по применению набора в разделе «Дополнительное оборудование и материалы»
Характеристики
| Основные | |
|---|---|
| Страна производитель | Россия |
Информация для заказа
- Цена: 5 000 ₸
Набор реагентов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 тяжелого острого респираторного синдрома (COVID-19) методом полимеразной цепной реакции «АмплиПрайм® SARS-CoV-2 DUO» по ТУ 21.20.23-083-09286667-2020
Набор реагентов выпускается в 4 формах выпуска:
Форма выпуска 1 в составе:
1. ПЦР-смесь-FL SARS-CoV-2 DUO — 0,01 мл х 100 пробирок.
2. Буфер D — 1,2 мл X 1 пробирка.
3. Taq полимераза-0,12 мл х 1 пробирка.
4. Ревертаза R- 0,03 мл х 1 пробирка.
5. К- — 0,2 мл X 1 пробирка.
6. ПКО SARS-CoV-2 DUO- 0,15 мл х 1 пробирка.
7. ВКО R — 1,2 мл X 1 пробирка.
8. ОКО — 1,2 мл X 2 пробирки.
Форма выпуска 2 в составе:
1. ПЦР-смесь-FL SARS-CoV-2 DUO — 1,2 мл х I пробирка.
2. Буфер С — 0,65 мл х 1 пробирка.
3. Taq полимераза- 0,12 мл х 1 пробирка.
4. Ревертаза R- 0,03 мл х 1 пробирка.
5. К- — 0,2 мл X 1 пробирка.
6. ПКО SARS-CoV-2 DUO — 0,15 мл х 1 пробирка.
7. ВКО R — 1,2 мл X 1 пробирка.
8. ОКО — 1,2 мл X 2 пробирки,
t
Форма выпуска 3 в составе:
1. ПЦР-смесь-FL SARS-CoV-2 DUO — 0,01 мл х 100 пробирок. (12,5 стрипов по 8 пробирок)
2. Буфер D — 1,2 мл X 1 пробирка.
3. Taq полимераза-0,12 мл х 1 пробирка.
4. Ревертаза R- 0,03 мл х 1 пробирка.
5. К- — 0,2 мл X 1 пробирка.
6. ПКО SARS-CoV-2 DUO — 0,15 мл х I пробирка.
7. ВКО R — 1,2 мл X 1 пробирка.
8. ОКО — 1,2 мл X 2 пробирки.
Форма выпуска 4 в составе:
1. ПЦР-смесь-FL SARS-CoV-2 DUO — 0,6 мл х 2 пробирки.
2. Буфер С — 0,3 мл X 2 пробирки.
3. Taq полимераза — 0,06 мл х 2 пробирки.
4. Ревертаза R — 0,015 мл х 2 пробирки.
5. К— 0,2 мл X 2 пробирки.
6. ПКО SARS-CoV-2 DUO — 0,15 мл х 2 пробирки.
7. ВКО R — 1,2 мл X 1 пробирка.
8. ОКО — 1,2 мл X 4 пробирки.
Комплект поставки:
1. Набор реагентов (форма выпуска 1,2,3 или 4)
2. Краткое руководство по применению набора в бумажном виде — 1 шт
3. Комплект вкладышей к набору в бумажном виде — 1 шт.
4. Инструкция по применению набора в электронном виде на официальном сайте Производителя:
http://www.nextbio.ru/reagents/.
5. Паспорт качества в электронном виде на официальном сайте Производителя:
httD://www.nextbio.ru/passDort/
Купить Набор реагентов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 тяжелого острого респираторного синдрома (COVID-19) методом полимеразной цепной реакции «АмплиПрайм® SARS-CoV-2 DUO» по ТУ 21.20.23-083-09286667-2020, лучшая цена, доставка по России. Для заказа у нас на сайте вы можете заполнить заявку в свободной форме на почту Адрес электронной почты защищен от спам-ботов. Для просмотра адреса в вашем браузере должен быть включен Javascript. или же воспользоваться формой заказа на сайте.
1.1 Экспресс-тест SARS-CoV-2-Антиген предназначен для быстрого качественного определения нуклеокапсидного антигена вируса SARS-CoV-2 методом иммунохроматографического анализа в назофарингеальных мазках, взятых у лиц с подозрением на COVID-19 во время острой фазы заболевания.
1.2 COVID-19 — это острое респираторное инфекционное заболевание с высоким фактором риска среди большинства людей. В настоящее время основным источником инфекции являются пациенты, инфицированные новым коронавирусом (SARS-CoV-2); бессимптомно инфицированные люди также могут быть источником инфекции. По данным текущего эпидемиологического исследования, инкубационный период составляет от 1 до 14 дней, в основном от 3 до 7 дней. Коронавирусы — это обширное семейство вирусов, вызывающих заболевания, варьирующиеся от простуды до более тяжелых заболеваний, таких как ближневосточный респираторный синдром (MERSCoV) и тяжелый острый респираторный синдром (SARS-CoV). Новый коронавирус (nCoV) — это новый штамм, который ранее не выявлялся у людей и был впервые обнаружен в 2019 году. Клиническими проявлениями являются системные симптомы, такие как лихорадка и усталость, сопровождающиеся сухим кашлем, одышкой и т.д., которые могут быстро развиваться в тяжелую пневмонию, расстройство дыхания и острую дыхательную недостаточность. Дистресс-синдром, септический шок, полиорганная недостаточность, тяжелые нарушения кислотно-щелочного обмена и другие симптомы еще более опасны для жизни.
1.3 Экспресс-тест для определения антигена коронавируса нового типа обнаруживает нуклеокапсидный антиген нового коронавируса в образце мазка, взятого из носоглотки человека. Тест может быть выполнен в течение 10 минут без использования лабораторного оборудования.
1.4 Наличие быстрого диагностического теста в месте оказания медицинской помощи имеет решающее значение в диагностике пациентов и предотвращении дальнейшего распространения вируса. Он предоставляет возможность получения предварительных данных в диагностике инфицирования новым коронавирусом.
Любая интерпретация или использование этого предварительного теста должна также основываться на других клинических данных, а также на профессиональном суждении медицинских работников. Следует принять к рассмотрению и альтернативные методы для подтверждения результатов, полученных с помощью этого теста.
1.5 Положительные результаты указывают на наличие вирусных антигенов, но для определения статуса инфекции необходимо сопоставление с другими клиническими данными пациента и другой диагностической информацией. Положительные результаты не исключают бактериальную инфекцию или коинфицирование другими вирусами.
1.6 Отрицательные результаты следует рассматривать как предварительные, они не исключают заражение вирусом SARS-CoV-2 и не должны использоваться в качестве единственной основы для принятия решений о лечении или наблюдения за пациентом, включая решения о контроле за инфекцией. Отрицательные результаты следует рассматривать в контексте недавних контактов пациента с источником заражения, истории болезни и наличия клинических признаков и симптомов, соответствующих COVID-19, и, если необходимо, подтверждать молекулярным анализом, для наблюдения за пациентом.
1.7 Экспресс-тест для обнаружения антигена предназначен для использования медицинским персоналом, специально проинструктированным и обученным методам диагностики in vitro и надлежащим процедурам инфекционного контроля, а также для индивидуального использования для самоконтроля состояния при острой респираторной инфекции.
2.1 Высокая скорость и простота использования иммунохроматографического анализа обеспечивается благодаря предварительному нанесению аналитических реагентов на мембрану тестовой кассеты. Контакт с пробой запускает иммунохимические реакции, приводящие к окрашиванию определенных участков мембранной полоски, по которому можно через 10 мин визуально регистрировать результат анализа.
2.2 Экспресс-тест предназначен для обнаружения присутствия или отсутствия нуклеокапсидного белка вируса SARS-CoV-2 в образцах мазков, взятых из носоглотки пациентов, подозреваемых на COVID-19, при наличии соответствующих признаков и симптомов. Когда образцы обрабатываются и добавляются в тестовое устройство, антигены вируса SARS-CoV-2, присутствующие в образце, связываются с антителами, меченными коллоидным золотом на тест-полоске. Комплексы антиген-антитело перемещаются по тест- полоске в зону реакции и захватываются линией антител, связанных на мембране.
2.3 Результат считается положительным, когда комплексы антиген-антитело, осажденные в позиции теста «Т», и контрольная позиция «С» на тестовом устройстве образуют цветные линии.
Результат считается отрицательным, когда цветная линия образуется только в позиции контроля «C», но не появляется видимая цветная линия в позиции теста «T».
2.4 Для контроля качества, чтобы гарантировать достоверность результата теста, цветная линия всегда должна появляться в позиции контроля «C», независимо от того, появляется ли результат (положительный или отрицательный) в позиции теста «T». Если в контрольной позиции «C» нет видимой линии, результат экспресс-теста считается недействительным, и необходимо провести новый тест.
Экспресс-тест SARS-CoV-2-Антиген может изготавливаться в следующих комплектациях:
а) комплектация 1 содержит:
— тестовая кассета, готова к использованию, упакована в пакет из фольги, 20 шт. Каждый пакет содержит 1 тест-кассету и 1 осушитель;
— тампон для взятия образцов, готов к использованию, в индивидуальной упаковке из бумаги с прозрачным верхом, 20 шт;
— экстракционная пробирка, готова к использованию, 20 шт;
— насадка для экстракционной пробирки, готова к использованию, 20 шт;
— буферный раствор для экстракции образцов, готов к использованию, 6 мл, 1 флакон (или 2 флакона по 3 мл);
— инструкция по применению.
б) комплектация 2 содержит:
— тестовая кассета, готова к использованию, упакована в пакет из фольги, 1шт. Каждый пакет содержит 1 тест-кассету и 1 осушитель;
— тампон для взятия образцов, готов к использованию, в индивидуальной упаковке из бумаги с прозрачным верхом, 1 шт;
— экстракционная пробирка, готова к использованию, 1 шт;
— насадка для экстракционной пробирки, готова к использованию, 1 шт;
— буферный раствор для экстракции образцов, готов к использованию, 0,5 мл, 1 пробирка;
— пипетка Пастера, 1 шт;
— инструкция по применению.
Необходимый, но не предоставляемый материал:
— таймер или часы;
— средства индивидуальной защиты, такие как защитные перчатки, медицинская маска, защитные очки и лабораторный халат;
— соответствующий контейнер для биологически опасных отходов и дезинфицирующие средства;
— калиброванная микропипетка на (0,05 — 0,5) мл с наконечниками для дозаторов.
3.1 Использовать экспресс-тест необходимо в строгом соответствии с инструкцией.
3.2 Этот экспресс-тест предназначен только для диагностики in vitro.
3.3 Со всеми образцами следует обращаться как с биомедицинскими отходами, содержащими потенциально инфекционные вещества. Процесс утилизации использованного экспресс-теста и материалов для образцов должен соответствовать местным законам об утилизации инфекционных веществ или лабораторным нормам.
3.4 Надевайте соответствующие средства индивидуальной защиты (например, халат, перчатки, очки, маску) при использовании экспресс-теста. Работы проводить с соблюдением мер предосторожности в соответствии с требованиями.
3.5 Правильный сбор, хранение и транспортировка образцов имеют решающее значение для выполнения этого теста.
3.6 После использования тестовую кассету необходимо утилизировать. Тест нельзя использовать более одного раза.
3.7 Не прикасайтесь к реакционной зоне тестовой кассеты.
3.8 Не используйте экспресс-тест после истечения срока годности.
3.9 Не используйте тестовую кассету, если пакет проколот или если его герметичность нарушена.
3.10 Тестирование должно проводиться специально обученным медицинским персоналом. Образцы также берутся квалифицированным медицинским персоналом.
3.11 Результат теста должен интерпретироваться врачом или обученным медицинским специалистом вместе с клиническими данными и результатами других лабораторных тестов.
3.12 Со всеми образцами и использованными экспресс-тестами следует обращаться как с биомедицинскими отходами, содержащими потенциально инфекционные вещества.
3.13 Результаты должны быть прочитаны сразу же по истечению 10 минут после введения образца в отверстие для образцов тест-кассеты. Результаты теста станут недействительными через 20 минут.
3.14 При взятии мазка из носоглотки используйте тампоны, входящие в комплект. Использование других тампонов может привести к ложноотрицательным результатам.
3.15 Перед использованием проверьте срок годности и целостность упаковки тестовой кассеты. Если упаковка тестовой кассеты повреждена и срок годности истек, его нельзя использовать.
3.16 Необходимо соблюдать время тестирования и считывания результатов.
3.17 После вскрытия пакета с тестовой кассетой, анализ следует провести в течение 60 мин. Тестовую кассету можно использовать только один раз.
3.18 Экспресс-тест должен храниться при температуре (2-30) °С. Беречь от влаги, прямых солнечных лучей, тепла и холода.
3.19 Результаты анализа предназначены для предварительной клинической оценки. Клинический диагноз заболевания следует рассматривать в сочетании с симптомами и признаками заболевания, историей болезни пациента, другими лабораторными тестами и ответом на лечение.
4.1 Настройка теста
Перед использованием экспресс-теста пакет с тестовой кассетой и буферный раствор должны быть доведены до комнатной температуры (18-25) °С.
Извлеките из пакета тестовую кассету непосредственно перед тестированием.
Пометьте тестовую кассету и экстракционную пробирку для каждого исследуемого образца. Поместите промаркированные экстракционные пробирки в штатив.
Снимите крышку с флакона с буфером для экстракции образца, держите флакон вверх дном. Сожмите флакон и добавьте 7 капель (~210 мкл) буферного раствора в пробирку для экстракции. При индивидуальном использовании экспресс-теста отобрать пипеткой Пастера буферный раствор из пробирки и добавить 9 капель (~210 мкл) в пробирку для экстракции.
4.2 Сбор образцов мазков из носа
Чтобы взять мазок из носа, осторожно вставьте тампон для взятия образцов в ноздрю с наибольшей секрецией при визуальном осмотре. Плавным вращением проталкивайте тампон до сопротивления на уровне носовых раковин (около 2,0-2,5 см вглубь ноздри). Прокрутите тампон 5 раз по стенке носа, затем выньте его из ноздри.
4.3 Подготовка образца
После взятия пробы немедленно погрузите тампон в буфер. Чтобы образец, извлеченный из тампона, полностью проник в буфер, 6 раз поверните тампон по стенке пробирки в течение 20 секунд, оставьте тампон в пробирке на 1 минуту, а затем пальцами, удерживая пробирку (стенка пробирки не твердая), несколько раз сожмите тампон, при этом медленно удаляйте его из пробирки. Прижатие тампона к стенке пробирки очень важно, так как при этом образца, содержащего жидкость, остается в пробирке как можно больше. Вынув тампон и выбросив его в контейнер для биологически опасных отходов, плотно наденьте насадку (входит в комплект) на верхнюю часть экстракционной пробирки и осторожно встряхните ее, чтобы качественно перемешать находящуюся внутри жидкость.
5.1 Удерживая экстракционную пробирку вертикально вверх дном. Сожмите ее и через насадку для экстракционной пробирки добавьте 3 капли (около 70-90 мкл) подготовленной ранее жидкости с образцом в центр лунки для образца (S-лунка), убедившись, что в ней нет пузырьков воздуха.
5.2 Запустите таймер. Считайте результат через 10 минут. Не более чем через 20 минут.
6.1 Положительный результат: как в позиции теста «T», так и в контрольной позиции «C» появляются видимые цветные линии. Если тестовая позиция «Т» имеет бледный цвет, результат также считается положительным (рисунок 2).
6.2 Отрицательный результат: цвет отображается только в контрольной позиции «C», а в позиции теста «T» окраски нет.
6.3 Недействительный результат: если контрольная позиция «C» остается без появления цвета, результат теста считается недействительным, поскольку контрольное обнаружение не сработало. В таком случае требуется повторное исследование образца.
6.4 Ограничения исследования
6.4.1 Этот экспресс-тест предназначен для обнаружения наличия или отсутствия антигенов к SARS-CoV-2 в респираторных образцах, взятых у лиц, имеющих контакт с COVID-19, или у лиц при наличии соответствующих признаков и симптомов заболевания в первые 7 дней.
6.4.2 Этот экспресс-тест представляет собой качественный анализ.
6.4.3 Точность анализа зависит от качества взятия пробы. Неправильный сбор образцов, их неправильное хранение повлияют на результат теста.
6.4.4 Результаты этого экспресс-теста предназначены для предварительной клинической оценки. Подтвержденный диагноз может быть установлен только после оценки всех клинических и лабораторных данных.
6.4.5 Из-за ограничений, которые имеет экспресс-тест для обнаружения антигенов, при отрицательных результатах тестирования рекомендуется использовать тест амплификации нуклеиновых кислот или методы идентификации вирусных культур для проверки и подтверждения результатов.
6.4.6 Положительные результаты анализов не исключают коинфицирование другими вирусами. Отрицательный результат этого экспресс-теста может быть вызван:
1) неправильным сбором образцов, неправильной передачей или использованием образцов;
2) уровень вируса SARS-CoV-2 ниже предела обнаружения теста;
3) вариации вирусных генов, которые могли вызвать изменения в детерминантах антигена.
7.1 Чувствительность экспресс-теста SARS-CoV-2-Антиген: 97,8%, в сравнении с тестом на нуклеиновую кислоту, были подтверждены положительные случаи.
7.2 Специфичность набора: 100 %, отрицательные случаи были также подтверждены тестом на нуклеиновую кислоту.
7.3 Воспроизводимость экспресс-теста SARS-CoV-2-Антиген: межсерийная 97%, внутрисерийная 99%.
7.4 Перекрёстная специфичность: перекрестная специфичность с вирусом гриппа A, вирусом гриппа B, аденовирусом, вирусом Коксаки, вирусом ECHO и энтеровирусом отсутствует; отсутствует перекрестная специфичность с Chlamydia pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia psittaci и Chlamydia trachomatis; отсутствует перекрестная специфичность с Acinetobacter baumannii, Bordetella pertussis, Candida albicans, Escherichia coli, Haemophilus influenzae и Neisseria gonorrhoeae.
8.1 Хранить при температуре (2-30) °С в запечатанном пакете до истечения срока годности. Не замораживать.
8.2 Тест-кассету следует использовать в течение 1 часа после ее извлечения из пакета.
8.3 Сразу после использования флакон с буфером для экстракции образца следует закрыть крышкой.
8.4 Экспресс-тест следует использовать до истечения срока годности.
8.5 Срок годности — 18 месяцев с даты изготовления.
УП «ХОП ИБОХ НАН Беларуси» ул. Академика В.Ф.Купревича, д.5, корп.3, 220141, г. Минск, Республика Беларусь
Тел./факс +375-17-272-52-57 E-mail: hopmang.bel@gmail.com http://www.hopiboh.org
По вопросам, касающимся качества набора, обращаться в ОТК, тел. +375-17-396-87-38
Рекламации на качество экспресс-тестов присылайте предприятию-производителю.
В случае нарушения предусмотренных производителем условий хранения,
транспортировки и процедуры постановки экспресс-теста, рекламации рассматриваются как необоснованные.