10.4. Определение энтерококков
Энтерококки — грамположительные, каталазоотрицательные, полиморфные круглые, или чаще слегка вытянутые с заостренными концами кокки, располагающиеся попарно или в коротких цепочках, способные расти на питательных средах с 0,04% азида натрия и характеризуются устойчивостью к росту в питательном бульоне при температуре 45 °C, в среде с 40% желчью и с 6,5% хлорида натрия, при pH 9,6, при температуре 60 °C в течение 30 мин.
К группе энтерококков относят Enterococcus faecalis с биоварами zymogenes и liquefaciens, который имеет основное индикаторное значение, Enterococcus faecium, Enterococcus durans.
Значение показателя и область применения.
Энтерококки — индикаторный показатель, обязательный для лабораторного, в том числе производственного контроля качества морской воды для хозяйственно-питьевого водопользования после опреснения, в местах водозаборов для плавательных бассейнов и водолечебниц, в зонах рекреации и в черте населенных мест.
Превышение нормативов по энтерококкам в морской воде свидетельствует о поступлении свежего фекального загрязнения и потенциальной эпидемической опасности объекта исследования.
10.4.1. Обнаружение энтерококков
методом мембранной фильтрации
Выполнение анализа. Объем испытуемой воды для посева выбирают с таким расчетом, чтобы не менее чем на двух фильтрах выросли изолированные колонии в количестве от 5 до 50 при диаметре фильтра 35 мм и от 10 до 100 при диаметре фильтра 47 мм.
При этом можно ориентироваться на результаты предыдущих исследований.
При исследовании воды неизвестного качества число засеваемых десятикратных объемов увеличивают до 3 — 4.
Отмеренный объем воды фильтруют через мембранные фильтры по п. 10.1.2. После фильтрации фильтр переносят, не переворачивая, на плотную азидную среду Сланеца-Бертли или энтерококкагар и добиваются полного прилегания его к среде без пузырьков воздуха. Чашки с посевами помещают в термостат дном вверх и инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение 24 — 48 ч.
Для учета выбирают фильтры, на которых выросло число колоний, указанное выше.
Подсчитывают колонии, характерные для энтерококков: выпуклые, с ровными краями, темно-малиновые, розовые, светло-розовые, равномерно окрашенные или с темно-красным не четко оформленным центром.
Очень мелкие (на пределе видимости невооруженным глазом), плоские разных оттенков, ярко-малиновые с четко выраженным центром и бесцветным ободком колонии не учитывают. Дифференциацию энтерококков от посторонней микрофлоры можно проводить по морфологии колоний под бинокулярной лупой.
При необходимости подтвердить наличие энтерококков по 2 — 3 колонии каждого типа:
— микроскопируют после окраски по Граму (МУК 4.2.1018-01) и при обнаружении в мазках грамположительных полиморфных, как правило, слегка вытянутых с заостренными концами диплококков дают положительный ответ;
— пересевают секторами на солевой агар с ТТХ; после 24 — 48 ч инкубации посевов при температуре 37 °C энтерококки на среде дают равномерный нежный рост на протяжении всего штриха. Иные бактерии на этой подтверждающей среде не растут;
— выполняют каталазный тест; для этого петлей наносят каплю дистиллированной воды на предметное стекло, в которой растирают исследуемую культуру. После подсушивания на воздухе добавляют каплю свежеприготовленной 3%-й перекиси водорода. При отсутствии пузырьков газа тест считается каталазоотрицательным. В качестве контрольной каталазоположительной культуры используют любой вид стафилококков.
Учет результатов. Для определения индекса подсчитанное число колоний энтерококков на фильтрах, где выросло менее 50 — 70 колоний, суммируют и делят на объем воды, профильтрованный через фильтры, на которых велся подсчет.
В протоколе исследования указывают КОЕ энтерококков в 100 мл воды.
10.4.2. Обнаружение энтерококков
титрационным методом
Выполнение анализа. Анализируемый объем морской воды и ее разбавления засевают параллельно в 2 или 3 ряда накопительной щелочно-полимиксиновой среды (ЩЭС). Объемы 100 и 10 мл засевают в равные объемы среды двойной концентрации; 1 мл исследуемой воды или ее разбавления засевают в 5 мл среды нормальной концентрации. Посевы инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C. Через 48 ч из посевов, где отмечены признаки роста (помутнение или помутнение и изменение цвета среды), производят пересев на 4 — 6 секторов одной из плотных питательных сред (молочно-ингибиторной — МИС, энтерококкагар или азидную среду Сланеца-Бертли). Плотные питательные среды инкубируют 24 — 48 ч при температуре (37 +/- 1) °C.
Учет результатов. В качестве положительных результатов на МИС отмечают наличие аспидно-черных, выпуклых колоний с металлическим блеском, ровными краями (Enterococcus faecalis), а также мелких сероватых колоний (Enterococcusfaecium, Enterococcus durans). На азидной среде и энтерококкагаре энтерококки образуют крупные выпуклые, темно-малиновые, розовые, светло-розовые, равномерно окрашенные или с темно-красным не четко оформленным центром. При необходимости подтвердить наличие энтерококков по 2 — 3 колонии каждого типа микроскопируют и выполняют каталазный тест или проверяют способность роста на солевом агаре с ТТХ.
Вычисляют наиболее вероятное число (НВЧ) КОЕ в 100 мл по одной из таблиц прилож. 3. В протоколе исследования указывают наиболее вероятное число КОЕ энтерококков в 100 мл воды.
10.4.3. Упрощенный метод определения энтерококков
Выполнение анализа. При анализе воды титрационным методом лактозо-пептонная среда используется одновременно для накопления ОКБ и энтерококков. Сначала делают высев из лактозо-пептонной среды для определения колиформных бактерий по п. 10.2.2, затем — на энтерококки. Из всех емкостей лактозо-пептонной среды, где имелось помутнение, независимо от наличия или отсутствия газа, делают высев со дна пробирки на сектора среды МИС, азидной среды или энтерококкагара, путем троекратного нанесения материала бактериологической петлей диаметром 2 — 3 мм для посева штрихом. Среды инкубируют 24 ч при температуре (37 +/- 1) °C.
Учет результатов производят по п. 10.2.2.
Скачать документ целиком в формате PDF
Солевой агар с 2,З,5-ТТХ 500 г.
| Производитель: | НПЦ «Биокомпас-С» (Россия) |
| Модель: | Солевой агар с 2,З,5-ТТХ 500 г. |
| Фасовка: | 500 г. |
| Срок годности: | 2 года |
| Наличие: | Есть в наличии |
-
3000.00 руб.
- Описание
- Отзывов (0)
Сухая питательная среда с полимиксином и 2,3,5-трифенилтетразолия хлоридом предназначена для обнаружения Bacillus cereus при санитарно-гигиенических исследованиях продуктов питания, сырья и контроле их производства.
ГОСТ 10444.8-88
Фасовка в пластиковые банки по 500 г.
Расход среды 100 г/дм3.
Цена дана за 1 упаковку с учетом НДС 20 %.
Описание
Визуальное обнаружение бактерий, выросших на питательной среде при посеве исследуемых образцов.
Форма выпуска
Выпускается в полиэтиленовых банках по 150, 200, 250 г с инструкцией по применению, паспорт (в комплекте поставки).
Назначение
Набор реагентов «Питательная среда для выделения энтерококков» предназначен для выделения энтерококков из клинического материала: отделяемое из ожоговых и хирургических ран, мочи, крови, фекалий и т.д. Изделие для диагностики ин витро. Функциональное назначение — вспомогательное средство в диагностике.
Характеристика набора
Выделение энтерококков осуществляется микробиологическим методом.
Принцип метода — визуальное обнаружение бактерий, выросших на питательной среде при посеве исследуемых образцов.
Набор реагентов представляет собой смесь компонентов из расчета г/л:
Питательный агар сухой (СПА) — 35,0
Экстракт кормовых дрожжей — 5,0
Д(+)- глюкоза -10,0
Сода кальцинированная — 6,0
Кристаллический фиолетовый — 0,001
Выпускается в полиэтиленовых банках по 150, 200, 250 г с инструкцией по применению, паспорт (в комплекте поставки). Ремонту и обслуживанию не подлежит.
Питательная среда должна обеспечивать рост тест-штаммов Enterococcus faecalis liguefacilus 1379 и Enterococcus faecalis zymogenes 7(з) при посеве по 0,1 мл микробной взвеси каждого тест-штамма из разведения 10′6 через 20-24 ч инкубации при температуре (37±1) °С в 3-х засеянных чашках в виде круглых, выпуклых колоний («Бя-форма), диаметром 1-2 мм.
Питательная среда должна_подавлять рост тест-штаммов Staphylococcus aureus 209- Р, Escherichia coli 3912/41 (055:К59), Proteus vulgaris HX19 222 через (22±2) ч инкубации при температуре (37±1) °С во всех засеянных чашках при посеве из разведения 10′1
по 0,1 мл микробной взвеси.
Меры предосторожности
Потенциальный риск применения изделия — класс 2 б.
При работе необходимо соблюдать правила техники безопасности в соответствии с ГОСТ Р 52905-2007 «Лаборатории медицинские. Требования безопасности», «Правила устройства, техники безопасности производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно- эпидемиологических учреждений системы Министерства здравоохранения» (Москва, 1981 г.), а также санитарные правила СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней»; СП 1.3.2518-09 «Дополнения и изменения № 1 к СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III — IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней; СП 1.3.2885-11 «Дополнения и изменения № 2 к СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III — IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней».
Утилизация изделий, пришедших в негодность, с истекшим сроком годности и изделий после контакта с биологическими образцами осуществляется в соответствии с требованиями СанПиН 2.1.7.2790-10 «Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с медицинскими отходами».
Оборудование и реагенты
Термостат, обеспечивающий температуру (37±1) °С
Флаконы стеклянные
Чашки Петри стерильные
Вода дистиллированная
Спиртовка
0,9 % раствор натрия хлорида
Анализируемые пробы
Объекты исследований в санитарной и клинической микробиологии.
Проведение анализа
Сухую смесь в количестве 56,0 г, тщательно размешивают в 1 л дистиллированной воды, кипятят не более 2 мин до полного расплавления агара.
Среду охлаждают до температуры 43-47 °С, перемешивают и, соблюдая правила асептики, разливают в стерильные чашки Петри слоем 3-4 мм. Затем чашки со средой подсушивают 60-90 мин при температуре (37+1) °С. Готовая среда в чашках Петри — прозрачная, светло-желтого цвета. Готовую среду можно использовать в течение 7 сут при условии хранения при температуре 2-8 °С или 2 сут при температуре 18-25 °С.
Взятие и посев материала осуществляют в соответствии с «Методическими указаниями по микробиологической диагностике заболеваний, вызываемых энтеробактериями» (М., 1984 г.) и приказом Минздрава СССР от 22.04.85 г. №535 «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-диагностических учреждений».
Посев мочи, кала осуществляют согласно «Методическим рекомендациям по выделению и идентификации энтерококков», 1983 г.
Условия хранения и эксплуатация набора
Набор реагентов необходимо хранить в герметично закрытой упаковке в сухом, защищенном от света месте при температуре от 2 до 25 °С.
Набор реагентов транспортируют при температуре от 2 до 25 °С.
Для получения надежных результатов необходимо строгое соблюдение настоящей Инструкции по применению.
|
M-Enterococcus Agar Base |
M1108 |
Эту среду в качестве селективной используют для выделения и подсчета энтерококков в воде, сточных водах, пищевых продуктах и других материалах мембранным методом.
Состав**:
|
Ингредиенты |
грамм /литр |
|
Гидролизат казеина |
15,00 |
|
Папаиновый перевар соевой муки |
5,00 |
|
Дрожжевой экстракт |
5,00 |
|
Глюкоза |
2,00 |
|
Калия дигидрофосфат |
4,00 |
|
Натрия азид |
0,40 |
|
Трифенилтетразолия хлорид (ТТХ) |
0,10 |
|
Агар-агар |
10,00 |
|
Конечное значение рН (при 25°С) 7,2 ± 0,2 |
** Состав выверен и доведен до соответствия необходимым параметрам
Приготовление:
Размешать 41,5 г порошка в 1000 мл дистиллированной воды. Подогреть для полного растворения частиц. НЕ АВТОКЛАВИРОВАТЬ И НЕ ПЕРЕГРЕВАТЬ СРЕДУ. Добавить, при необходимости, 0,5 мл твина-80 и 2 мл 10%-ного водного раствора карбоната натрия. Разлить в чашки Петри.
Предупреждение: Азид натрия имеет тенденцию к образованию взрывчатых соединений с металлами, поэтому рекомендуется использовать много воды для удаления остатков среды.
Принцип и оценка результата:
Эта среда разработана Slanetz, Bent и Bartley (1) для подсчета энтерококков методом мембранных фильтров. Slanetz и Bartley (2) модифицировали ее, добавив трифенилтетразолий, и нашли, что колоний образуется больше и они крупнее, если фильтры накладывать прямо на поверхность агара, а не на подложку, смоченную бульонной средой. Эта среда высокоселективна. Для повышения чувствительности при прямом посеве пищевых продуктов и увеличения размеров колоний другие авторы (3, 4) использовали добавление твина-80 (0,5 мл/л) и карбоната натрия (2 мл 10%-ного раствора на 1 л среды).
Гидролизат казеина, папаиновый перевар соевой муки, дрожжевой экстракт и глюкоза служат источником углерода, азота и других веществ, необходимых для роста бактерий. Азид натрия подавляет рост грамотрицательных микроорганизмов. ТТХ служит быстрым индикатором бактериального роста. Он восстанавливается до нерастворимого формазана внутри бактериальных клеток и обеспечивает красное окрашивание колоний.
Контроль качества:
Внешний вид порошка:
Гомогенный сыпучий желтый порошок.
Плотность готовой среды:
Образуется среда, соответствующая по плотности 1,0%-ному агаровому гелю.
Цвет и прозрачность готовой среды:
Среда имеет светло-розовую окраску, прозрачна или слегка опалесцирует, если в чашках Петри формируется гель.
Кислотность среды:
При 25°С водный раствор (4,15% вес/об) имеет рН 7,2 ± 0,2.
Культуральные свойства:
Ростовые характеристики референс-штаммов через 24-48 ч при 37°С.
|
Штаммы микроорганизмов (АТСС) |
Рост |
Цвет колоний |
|
Enterococcus faecalis (29212) |
Обильный |
Розовые или темно-красные (марон) |
|
Escherichia coli (25922) |
Подавляется |
– |
Ссылки:
1. Slanetz, Bent and Bartley, 1955, Publ. Health. Rep., 70:67.
2. Slanetz and Bartley, 1957, J. Bact., 74:591.
3. Burkwell and Hartman, 1964, Appl. Microbiol., 12:18.
4. MacFaddin J. F., 1985, Media For Isolation-Cultivation-Identification-Maintenance of Medical Bacteria., Vol. 1, Williams and Wilkins, Baltimore.
5. Greenberg A. E., Trussell R. R. and Clesceri L. S. (Eds.), 1985, Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 16th ed., APHA, Washington, D.C.
6. Speck M. (Ed.), 1984, Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 2nd ed., APHA, Washington, D.C.
Условия и сроки хранения:
Порошок хранить при температуре ниже +25°С. Использовать до даты, указанной на этикетке. Готовую среду хранить не рекомендуется.
Среды для санитарно-бактериологических исследований
| Кат. № | Наименование | Инструкция по применению |
|---|---|---|
| О146 | Питательная среда для определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов сухая (Среда КМАФАнМ) | Инструкция |
| О145 | Питательная среда неселективного для накопления бактерий сухая (Забуференная пептонная вода) | Инструкция |
| О144 | Питательная среда для накопления сальмонелл сухая (Селенитовый бульон) | Инструкция |
| О232 | Питательная среда для определе-ния лизиндекарбоксилазы сухая (Среда с лизином) | Инструкция |
| О229 | Питательная среда для выделения и идентификации энтеробактерий сухая (Среда Кода) | Инструкция |
| О234 | Цитратный агар Кристенсена | Инструкция |
| О141 | Питательная среда для селективного определения колиформных бактерий и E.coli сухая (ЕС-бульон) | Инструкция |
| О147 | Питательная среда для селективного выделения и идентификации листерий сухая (ПАЛКАМ-агар) | Инструкция |
| О151 | Селективный бульон для обогащения листерий сухой (Бульон UVM) | Инструкция |
| О251 | Желточный агар с маннитом и феноловым красным (MYP агар) | Инструкция |
| О155 | Питательная среда для выращивания дрожжевых и плесневых грибов сухая (Агар Сабуро) | Инструкция |
| О156 | Селективный питательный агар для выделения и учета дрожжевых и плесневых грибов с хлорамфениколом сухой (Агар Сабуро с хлорамфениколом) | Инструкция |
| О230 | Питательная среда для культивирования облигатно-анаэробных микроорганизмов сухая (среда Китта-Тароцци) | Инструкция |
| О148 — О150 | Питательная среда для выделения и подсчета сульфитредуцирующих бактерий растущих в анаэробных условиях (Железосульфитный агар) | Инструкция |
| О220 | Питательная среда для выявления и подсчета сульфитредуцирующих бактерий, растущих в анаэробных условиях (Среда Вильсон-Блера) | Инструкция |
| О140 | Питательная среда для выделения, подсчета и культивирования лактобацилл сухая (MRS-агар) | Инструкция |
| О160 | Питательная среда для селективного накопления сальмонелл су-хая (Основа среды Мюллер-Кауфмана) | Инструкция |
| О178 | Сахарозо-лактозный агар с бриллиантовым зеленым и феноловым красным сухой (БФЛС-ГРМ агар) | Инструкция |
| О172 | Агар с бриллиантовым зеленым и феноловым красным, сухой (агар Эделя-Кампельмахера) | Инструкция |
| О181 | Питательный агар для селективного выделения патогенных стафилококков сухой (Маннит-солевой агар) | Инструкция |
| О177 | Питательная среда для селективного выделения псевдомонад сухая (Цетримидный агар) | Инструкция |
| О182 | Бульон для выделения стафилококков сухой (Солевой бульон) | Инструкция |
| О203-О204 | Питательная среда для определения и подсчета бифидобактерий (среда ОББ) | Инструкция |
| О205 | Питательная среда для определения и подсчета молочнокислых стрептококков сухой (Агар М 17) | Инструкция |
| О183-О184 | Питательная среда для выявления молочнокислых бактерий сухая (Среда Бликфельдта) | Инструкция |
| О236-О250 | Питательная среда для идентификации энтеробактерий сухая (Среда Гисса с бромкрезоловым пурпуровым) | Инструкция |
| О235 | Питательная среда для обнаружения и подсчета энтерококков (Среда Сланец-Бартли) | Инструкция |
| О212 | Глюкозо-пептонная среда | Инструкция |
| О213 | Лактозо-пептонная среда | Инструкция |
| О211 | Питательная среда для дифференциации энтеробактерий по тесту дезаминирования фенилаланина сухая (Фенилаланин-агар) | Инструкция |
| О92 | Питательная среда для идентификации энтеробактерий сухая (Ацетатный агар) | Инструкция |
| О252 | Питательная среда для родовой дифференциации энтеробактерий сухая (Малонатный агар) | Инструкция |
| О256 | Глюкозо-фосфатный бульон (Среда Кларка) | Инструкция |
| О257 | Питательная среда с триптофаном сухая | Инструкция |
| О258 | Питательная среда для проведения ОФ-теста сухая (Среда Хью-Лейфсона) | Инструкция |
| О259 | Питательная среда для выделения и идентификации энтерококков сухая (желчь-эскулин-азидный агар) | Инструкция |